Desarrollo, optimización e implementación de un protocolo biológico de reconocimiento del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFα) mediante técnicas de resonancia plasmónica superficial.

Abstract

El TNFα es una citoquina proinflamatoria con diversas funciones en el organismo. Está implicada en múltiples acciones fisiológicas como la hematopoyesis, el sistema inmune y la regresión tumoral. Debido a su importancia, cuando algo falla en su regulación o funcionamiento, tiene graves y diversas consecuencias patológicas. Por ello, es la molécula diana de muchos tratamientos efectivos para enfermedades inflamatorias como el síndrome de Crohn, la aterosclerosis la artritis reumatoide. Sin embargo, a día de hoy no se realiza de manera rutinaria su determinación para el diagnóstico en análisis clínico. Ni siquiera se lleva a cabo el seguimiento de los niveles de esta molécula en pacientes tratados con fármacos terapéuticos anti TNFα. Las únicas técnicas actuales para medir su concentración son la ELISA y las técnicas basadas en ella sólo se utilizan en estudios de investigación debido a su elevado coste. Por un lado, este trabajo ha pretendido impulsar el conocimiento sobre el TNFα mediante una revisión exhaustiva de la bibliografía recogida hasta ahora en artículos y libros científicos. Por otro lado, se ha caracterizado su detección diseñando un protocolo para la formación de una estructura de reconocimiento biológico de la citoquina con el uso de las SAMs mediante técnicas de resonancia plasmónica superficial (SPR). Para ello, se han optimizado todos los parámetros del procedimiento paso por paso. Se ha comenzado con el tipo de SAM, concentraciones y técnicas de formación estudiadas. Después, se ha analizado la adición de distintos bloqueantes de oro y desactivadores de SAM al proceso con el fin de minimizar las uniones inespecíficas. Se ha continuado con el estudio de las condiciones óptimas para la activación de la SAM y la inmovilización del ligando para poder detectar el máximo de analito posible, probando distintas concentraciones de TNFα con las condiciones óptimas obtenidas. Por último, utilizando la estructura de biorreconocimiento de TNFα óptima, se han analizado diferentes muestras de plasma de ratas sanas y con esteatosis inducida proporcionadas por el Hospital Donostia, pudiendo distinguir entre las que tenían concentraciones basales y elevadas de TNFα en plasma con el sistema diseñado. Además, se ha caracterizado cada paso optimizado con técnicas de diversa índole. Este proyecto ha permitido profundizar en el conocimiento del TNFα, los biosensores, las técnicas libres de marcaje y las monocapas autoensambladas, además de la optimización del protocolo de obtención de una estructura de biorreconocimiento para la detección de TNFα mediante técnicas de resonancia plasmónica superficial, obteniendo el diseño y producción de una SAM efectiva para este caso.