Development of the advanced genetic therapies for Primary Hyperoxaluria type I
Palabras clave : 
Ingeniería genética
Metabolismo humano
Materias Investigacion::Ciencias de la Salud::Genética
Fecha de publicación: 
30-oct-2018
Fecha de la defensa: 
26-feb-2018
Cita: 
ZABALETA, N. "Development of the advanced genetic therapies for Primary Hyperoxaluria type I", González-Aseguinolaza, G. y Rodríguez, J. R. (dirs). Tesis doctoral. Universidad de Navarra, Pamplona, 2018.
Resumen
Primary Hyperoxaluria type I (PH1) is an inherited inborn error of the glyoxylate metabolism in the liver. It is caused by mutations in the AGXT gene, a gene that codes the peroxisomal enzyme alanine-glyoxylate aminotransferase (AGT). As a result of AGT deficiency oxalate, which is an end-product of glyoxylate metabolism, is overproduced in the liver. In healthy individuals, oxalate is excreted into urine, but when it is produced at high concentration there is a tendency for calcium oxalate (CaOx) crystals to be generated and deposited in the renal parenchyma, where kidney stones can form. As a consequence, PH1 patients present with severe kidney damage and poor survival of kidneys, developing end-stage renal disease (ESRD) in most of the cases. The only curative treatment is liver transplantation, which is usually combined with kidney transplantation because of the loss of renal function. The main goal of this study was to develop new therapeutic alternatives for PH1 based on advanced genetic treatment. In the initial part of this thesis we tried to improve PH1 gene therapy using adeno-associated viral (AAV) vectors. First, human AGXT was codon optimized in order to improve the expression levels of the protein. In this case, the optimization of the sequence of the AGXT gene resulted in no therapeutic advantage in comparison to the WT version of the gene. Second, we worked on the optimization of AAV gene delivery to the liver in non-human primates (NHP) changing the route of administration. It was demonstrated that the direct administration of AAV vectors into the hepatic blood flow resulted in a higher transduction of the liver in comparison to the systemic intravenous route. In addition, a completely novel approach based on gene editing using the recently discovered clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system was designed and characterized. This treatment was focused on a substrate reduction therapy (SRT) strategy, i.e. the reduction of glyoxylate production (the precursor of oxalate). Glycolate oxidase (GO) enzyme is a liver peroxisomal enzyme in charge of the production of glyoxylate. The inhibition of GO synthesis is known to reduce oxalate production. Therefore, a specific CRISPR/Cas9 system was designed to target and disrupt the Hao1 gene (the gene that codes GO) in hepatocytes. Using this strategy we were able to efficiently reduce GO protein levels. Moreover, the treatment resulted in a significant reduction of oxalate production and of renal damage in PH1 mice challenge with oxalate precursors, in absence of toxicity. In conclusion, several strategies to treat PH1 were developed and optimized during this project, which were able to reduce oxalate excretion in the urine of the PH1 mouse model.
La Hiperoxaluria Primaria de tipo I (PH1 de las siglas en inglés) es una enfermedad hereditaria hepática causada por mutaciones en el gen AGXT, que codifica para la enzima peroxisomal alaninaglioxilato aminotransferasa (AGT). Debido a la deficiencia de AGT se sobreproduce oxalato en el hígado, un producto de desecho del metabolismo del glioxilato. En individuos sanos, el oxalato se excreta en orina, pero cuando se produce en concentraciones elevadas tiende a generar cristales de oxalato cálcico (CaOx) que sedimentan en el parénquima renal y forman piedras en el riñón. En consecuencia, los pacientes que padecen PH1 presentan un daño renal severo y baja supervivencia renal, desarrollando en la mayoría de los casos enfermedad renal terminal (ESRD de las siglas en inglés). El único tratamiento curativo es el trasplante hepático, que normalmente debe ser combinado con trasplante renal debido a la pérdida de función renal. El principal objetivo de este estudio era el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas para PH1 basadas en terapias genéticas avanzadas. La primera parte de esta tesis está dirigida a la mejora de la terapia génica de PH1 mediante vectores AAV. En primer lugar, se optimizó la secuencia de codones del gen AGXT humano con el objetivo de incrementar los niveles de proteína. En este caso, la optimización de la secuencia de AGXT no confirió ventaja terapéutica en comparación con la versión WT. En segundo lugar, hemos tratado de mejorar los niveles de transducción del AAV en el hígado mediante la administración del vector por distintas vías en primates no humanos (NHPs). Se ha demostrado que la administración directa de los vectores AAV en el torrente sanguíneo hepático aumenta la transducción en comparación con la ruta intravenosa sistémica. Además, se ha diseñado y caracterizado una aproximación complemente nueva basada en la edición génica mediante los sistemas CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9). Este tratamiento estaba centrado en la estrategia de reducción de sustrato (SRT), es decir, en la reducción de la producción del glioxilato (el precursor del oxalato). La glicolato oxidasa (GO) es una enzima peroxisomal hepática encargada de la producción del glioxilato. Se sabe que la inhibición de la síntesis de GO es capaz de reducir la producción de oxalato. Por lo tanto, se ha diseñado un sistema CRISPR/Cas9 específico dirigido a la destrucción del gen Hao1 (el gen que codifica GO) de los hepatocitos. Mediante esta terapia fuimos capaces de reducir eficientemente los niveles de proteína de GO. Además, el tratamiento redujo significativamente el nivel de oxalato producido y el daño renal en ratones PH1 estimulados con precursores de oxalato, en ausencia de toxicidad. En conclusión, a lo largo de este proyecto se han desarrollado y optimizado varias estrategias para tratar PH1, que fueron eficaces para reducir la excreción de oxalato en la orina de los ratones PH1.

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El fichero será visible a partir del 26-dic-2018


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