Design and validation of advanced image analysis tools for the quantification of cancer cell migration in microfluidic microdevices

Abstract

This thesis presents the design and validation of advanced image analysis and machine learning tools for the quantitative analysis of three-dimensional (3D) lung cancer cell migration. These tools were used to study the role that the composition and the morphological and mechanical properties of the microenvironment have in cancer cell migration. Cell migration experiments were performed using in vitro cellular models consisting of custom-made microfluidic devices, which provide a high level of control of the properties of the microenvironment, offer optimal optical properties for microscopic observation and ensure appropriate use of reagents due to their microscopic dimensions. Varying migration environmental conditions were simulated by embedding the cells in biomimetic hydrogels of different composition and, thus, with different morphological and mechanical properties. These hydrogels act as the 3D extracellular matrix (ECM) of the cells. Namely, we used hydrogels made of pure collagen type I to mimic normal connective tissue and hydrogels made of a mixed composition of collagen and Matrigel to simulate the disorganized basement membrane at the leading edge of cancer invasion. The migration experiments performed within the hydrogels were done with and without serum stimulation to determine the role of hydrogel extrinsic and intrinsic growth factors in cell migration. Furthermore, migration experiments were performed with and without blocking cellular integrins to determine the role of the cell-to-ECM interactions in cell migration, and with and without metalloproteinase (MMP) inhibitors to understand the role of ECM in cell migration. Migration experiments were performed at two resolution levels. First, low-resolution experiments were performed to determine globally the effect of the parameters analyzed in the dynamics of cancer cell migration. This required detecting and tracking a large number of cancer cells, imaged at low magnification (10×) using widefield phase-contrast and fluorescence microscopy. Second, high magnification (63×) migration experiments were used to study the morphology of migrating cancer cells, by measuring the number, length and life time of cell protrusions produced during the migration. This required the use of laser scanning confocal microscopy. The microscopy time-lapse sequences generated in both types of experiments were analyzed using novel image processing and machine learning techniques in order to obtain robust quantifiable metrics of cell migration dynamics and migrating phenotype in 3D environments. This thesis describes the experiments performed along with the image processing and computational algorithms used to analyze cell migration both in low- and high-magnification image data. We provide the source code of the developed analysis software, for its use and future algorithmic improvement by the research community.

Esta tesis presenta el diseño y la validación de herramientas avanzadas de análisis de imagen y de aprendizaje automático para el análisis cuantitativo de la migración tridimensional (3D) de células de cáncer de pulmón. Estas herramientas se utilizaron para estudiar el papel que tiene la composición y las propiedades morfológicas y mecánicas del microambiente en la migración de células cancerígenas. Los experimentos de migración celular se llevaron a cabo usando modelos celulares in vitro consistentes en dispositivos microfluídicos hechos a medida, los cuales proporcionan un alto nivel de control de las propiedades del microambiente, ofrecen propiedades óptimas para la observación microscópica y aseguran el uso apropiado de reactivos debido a sus dimensiones microscópicas. Las diferentes condiciones ambientales de la migración se simularon embebiendo las células en hidrogeles biomiméticos de diferente composición y, por lo tanto, con diferentes propiedades morfológicas y mecánicas. Estos hidrogeles actúan como la matriz extracelular 3D (MEC) de las células. En concreto, se han utilizado hidrogeles hechos de colágeno puro tipo I para simular el tejido conectivo normal e hidrogeles de una composición mixta de colágeno y Matrigel para simular la membrana basal desorganizada en el frente de invasión del cáncer. Los experimentos de migración realizados dentro de los hidrogeles se realizaron con y sin estimulación con suero para determinar el papel de los factores de crecimiento extrínsecos e intrínsecos del hidrogel en la migración celular. Además, se realizaron experimentos de migración con y sin bloqueo de integrinas celulares para determinar el papel de las interacciones célula-MEC en la migración celular, y con y sin inhibidores de metaloproteinasas (MMP) para comprender el papel de la MEC en la migración celular. Los experimentos de migración se realizaron en dos niveles de resolución. Por una parte, se realizaron experimentos a baja resolución para determinar globalmente el efecto de los parámetros analizados en la dinámica de la migración de células cancerígenas. Esto requirió detectar y seguir un gran número de células cancerígenas, con imágenes de baja magnificación (10×) utilizando microscopía de contraste de fase y de fluorescencia de campo amplio. Por otra parte, se realizaron experimentos de migración a alta magnificación (63×) para estudiar la morfología de las células cancerígenas mientras migran, midiendo el número, longitud y tiempo de vida de las protrusiones celulares producidas durante la migración. Esto requirió el uso de microscopía confocal de barrido láser. Las secuencias de microscopía de lapso de tiempo generadas en ambos tipos de experimentos se analizaron utilizando novedosas técnicas de procesamiento de imagen y de aprendizaje automático para obtener métricas cuantificables robustas de la dinámica de la migración celular y del fenotipo de migración en entornos 3D. Esta tesis describe los experimentos realizados junto con los algoritmos computacionales y de procesamiento de imagen utilizados para analizar la migración celular en imágenes de baja y alta magnificación. Proporcionamos el código fuente del software de análisis desarrollado para su uso y futura mejora algorítmica por parte de la comunidad investigadora.