Comprehensive DNA methylation profiling of chronic myeloproliferative neoplasms and discovery of ZFP36L1, a novel tumour suppressor gene epigenetically regulated by enhancer DNA methylation in myelofibrosis

Abstract

La Policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP) forman parte de las neoplasias mieloproliferativas crónicas (NMPC). Éstas neoplasias presentan un curso clínico variable, supervivencia prolongada, riesgo de progresión a mielofibrosis secundaria (PV y TE) y un riesgo variable de transformación a leucemia mielode aguda (LMA). Las mutaciones genéticas no consiguen explicar la heterogeneidad fenotípica y clínica de las NMPC, no obstante su prevalencia y diversidad. La epigenética y en concreto la metilación del DNA podrían contribuir a explicar la heterogeneidad observada en las NMPC.

Se realizó un estudio de la metilación del DNA en NPMC mediante microarrays de metilación. En la primera parte, se estudió la metilación del DNA mediante el array Illumina Infinium® 27k en muestras de PV, ET, MFP y transformaciones a LMA; en la segunda parte, se estudió la mielofibrosis (MF) tanto primaria como secundaria, utilizando el array de Illumina Infinium® 450K (segunda generación). El análisis bioinformático se realizó identificando regiones diferencialmente metiladas y posteriormente utilizando herramientas bioinformáticas para contextualizar regiones/genes diferencialmente metilados.

En la primera parte se analizaron 71 muestras (24 PV, 23 TE, 24 MFP), 13 muestras de transformación a LMA y 8 controles sanos. Se encontraron 176 regiones diferencialmente metiladas, que permitieron segregar las muestras de donantes sanos y las de NMPC mediante clusterización supervisada. El estudio de los genes diferencialmente metilados reveló que la vía NF-kB se encuentra alterada por perdida de metilación en las NMPC (Ingenuity Pathway analysis) y que los genes identificados están involucrados en procesos celulares relevantes (Gene Ontology) para el fenotipo neoplásico. El perfil de metilación de las NMPC transformadas permitió segregar las muestras de transformación a LMA de las NMPC en fase crónica y las muestras de donantes sanos, sugiriendo que la metilación del DNA contribuye al proceso de transformación a LMA.

En la segunda parte se analizaron 22 muestras de MFP, 17 muestras de MF secundaria y 8 donantes sanos. Los perfiles de metilación del DNA de la MF primaria y secundaria fueron comparables, permitiendo agrupar la MF en una única cohorte. Se observó un enriquecimiento significativo de metilación aberrante en las regiones enhancer, nunca antes descrito en la MF. Utilizando los enhancers diferencialmente metilados, se obtuvo un perfil de metilación de DNA que permitió segregar la MF de los donantes sanos, con clara predominancia de la pérdida de metilación del DNA. Los genes adyacentes a los 9000 enhancers mostraron enriquecimiento en procesos celulares relevantes (Gene Ontology) y una correlación inversa entre la hipermetilación y la expresión, sugiriendo que la metilación de los enhancers es relevante para el control de la expresión génica en MF.

Se obtuvo una lista de 27 genes candidatos con hipermetilación de su enhancer y se escogió ZFP36L1 para estudios funcionales. Se demostró que el enhancer de ZFP36L1 tiene ganancia de metilación y pérdida de expresión en muestras independientes de MF y en líneas celulares mieloides. Experimentos con el vector p-CPGL, demostraron la funcionalidad de la región enhancer de ZFP36L1, sugiriendo que ésta región es suficiente para la regulación de la expresión del gen.

La proteína ZFP36L1 participa en el control de la degradación exosómica del mRNA. La re-expresión del ZFP36L1 en la línea celular SET-2 (infección lentiviral o PMA) consiguió alterar el fenotipo neoplásico, asociándose a una reducción de la proliferación celular, aumento de apoptosis y a una disminución de la expresión de CDK6. La pérdida epigenética de ZFP36L1 podría asociarse a una menor degradación y aumento de la disponibilidad de mRNA CDK6, suscitando progresión descontrolada del ciclo celular y constituyendo ZFP36L1 como un potencial supresor tumoral en MF.