Generación de células humanas con potencial quimérico

Abstract

En la actualidad existe escasez de órganos disponibles para trasplante, por lo que es necesario buscar alternativas para satisfacer la demanda en la clínica. La complementación de blastocisto se erige como una prometedora estrategia en la generación de órganos «humanizados» en animales grandes como el cerdo. Esta estrategia consiste en la microinyección de células pluripotentes en embriones modificados genéticamente inhabilitados para generar el órgano de interés, y una posterior transferencia embrionaria a una madre receptora para su desarrollo embrionario. En este contexto, las células exógenas que sí son capaces de generar el órgano colonizarán el nicho vacío del embrión y generarán el órgano de interés. Como resultado, al animal quimera tendrá el órgano exclusivamente formado por las células exógenas. Mediante complementación de blastocisto se han generado órganos funcionales interespecie en estadio adulto en quimeras rata-ratón. Sin embargo, la generación de dichos órganos humanizados en quimeras humano-cerdo es todavía propiamente una quimera. Las células capaces de generar órganos interespecie rata-ratón presentan un estadio de pluripotencia naïve, equivalente al epiblasto de un blastocisto preimplantacional. Sin embargo, las células humanas pluripotentes obtenidas convencionalmente presentan un estadio de pluripotencia primed, similar al epiblasto de un embrión de post-implantación incapaz de generar quimeras. En esta tesis se ha estudiado la conversión desde el estadio primed al estadio naïve de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) con diferentes condiciones de cultivo (5iLAF y NEHSM) y se han caracterizado adecuadamente los estadios naïve y primed. Además, mediante un análisis de scRNA-seq en las hiPSCs cultivadas con la condición 5iLAF, hemos descrito por primera vez diferentes poblaciones coexistiendo en el mismo cultivo que imitan los tipos celulares de un embrión humano de preimplantación. Estas poblaciones son; células similares al embrión humano de 8 células, epiblasto, trofectodermo y endodermo primitivo (Moya-Jódar et al., 2023, Stem Cell Reports). Gracias a estos resultados, las células convertidas con el medio 5iLAF podrían utilizarse como alternativa al uso de embriones humanos de preimplantación. Con la intención de potenciar la capacidad de quimerismo de las células humanas, en esta tesis también se han generado quimeras humano-ratón modulando la competencia celular. Dado que c-Myc es un gen clave en la competencia celular durante el desarrollo embrionario de los mamíferos, se ha utilizado el cruce de un modelo de ratón c-MycHET en combinación con un KI de una copia extra de C-MYC en las hiPSCs, consiguiendo aumentar el potencial de quimerismo humano-ratón tanto in vitro como in vivo. Además, modulando la competencia celular mediante la microinyección de hiPSCs C-MYC KI en embriones de cerdo, se ha conseguido generar quimeras humano-cerdo in vitro. Por último, en la complementación de blastocisto es necesario disponer de embriones deficientes para el gen de interés. Puesto que el sistema vascular es el principal causante del rechazo inmunológico en los xenotrasplantes, en esta tesis se ha optimizado la generación de embriones de cerdo deficientes para el gen ETV2, un factor de trascripción clave en el desarrollo del sistema vascular y hematopoyético. Se ha utilizado la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 directamente en cigotos porcinos consiguiendo obtener embriones de cerdo de preimplantación ETV2 KO de manera eficiente (Moya-Jódar et al., 2022, Animals).